生物活性玻璃体外矿化测试方法

【主要技术内容】 1 试验试剂和测试器具 1.1 试验试剂 试验所用试剂有： a）NaCl（分析纯）； b）NaHCO3（分析纯）； c）KCl（分析纯）； d）KHPO4·3H20（分析纯）； e）MgCl2·6H20（分析纯）； f）盐酸溶液（分析纯）浓度1mol/L； g）CaCl2（分析纯）； h）Na2SO4（分析纯）； i）Tris（分析纯）； j）去离子水。 1.2 测试器具 试验所用测试器有∶ a）集热式磁力搅拌器； b）pH计； c）电子分析天平∶精度0.001g； d）烧杯2L； e）量筒50mL、1L； f）容量瓶1L； g）聚四氟乙烯瓶∶1L。 2 两种常用的体外矿化液的配制 2.1 Tris-HCl缓冲液 2.1.1 所需试剂 Tris-HCl缓冲液配制所需试剂如下： a）去离子水：700mL； b）Tris: (6.00±0.50)g; c）盐酸溶液∶35mL，浓度为1mol/L。 2.1.2 配制步骤 2.1.2.1 搅拌状态下将35mL，浓度为1mol/L的盐酸溶液加入到700mL去离子水中。 2.1.2.2 缓慢加入Tris，使其pH不超过7.45，并调节pH值为7.40。 2.1.2.3 将调整好pH的溶液定容至1000mL，并转移至干净、内表面光滑的聚四氟乙烯瓶中，置于4℃冰箱冷藏备用。 注∶使用时，应检查并保证Tris-HCl溶液处于澄清状态，若浑浊则不能再使用，应重新配制，并且使用有效期为30天。 2.2 模拟体液 2.2.1 所需试剂 配制模拟体液所需试剂及用量见表1。 表1 配制模拟体液所需试剂及用量 加入次序 试剂 加入量 1 NaCl 8.035g 2 NaHCO3 0.355g 3 KCl 0.225g 4 KHPO4·3H2O 0.231g 5 MgCl2·6H20 0.311g 6 盐酸溶液a 39mL 7 CaCl2 0.292g 8 Na2SO4 0.072g 9 Tris 6.118g 10 盐酸溶液 0mL~5mL a“盐酸溶液浓度为1mol/L。 2.2.2 配制步骤 2.2.2.1 向烧杯中加入700mL去离子水，搅拌并调节水温至（36.5±1.5）℃。 2.2.2.2 按表1中所列顺序在（36.5±1.5）℃下逐个溶解试剂1~8。 2.2.2.3 溶液温度恒定在（36.5±1.5）℃，称取试剂9后，少量多次的缓慢加入至混合溶液中，搅拌至完全溶解。 2.2.2.4 在（36.5±1.5）℃的条件下，保持搅拌并逐滴加入试剂10，精确调整pH值至7.40。 2.2.2.5 将调整好pH的溶液定容至1000mL，并转移至干净、内表面光滑的聚四氟乙烯瓶中，置于4℃~8℃冰箱冷藏备用。 注∶配制过程中不能同时溶解多个试剂，下一个试剂必须在前一试剂完全溶解之后加入。称量吸湿性试剂动作要尽量快，整个配制过程需要确保溶液无色、透明、容器表面无沉淀出现，如果过程中产生沉淀，倒去溶液洗净器具重新配制。 3 材料的体外矿化 3.1 密质薄片材料 3.1.1 对于密质薄片材料，测出样品尺寸并计算样品表面积。应用式（1）计算出体外矿化液用量∶Vs=Sa/10……………(1) 式中: Vs——体外矿化液的体积，单位为毫升（mL）； Sa————样品的表面积，单位为平方毫米（mm2）。 3.1.2 按照这个比例，得到样品的表面积和矿化液的比例为10mm2/mL。 3.1.3 将计算好的体外矿化液加入到聚四氟乙烯瓶中，预热至37℃，放入样品并置于37℃、100rpm 的恒温摇床中震荡。在规定时间取出样品，样品以去离子水和丙酮交替淋洗，之后置于电热恒温干燥箱中105 ℃干燥24h，得到矿化后的样品进行后续测试。 注∶若有需要，可收集上清液用于检测矿化相关离子的浓度变化。 3.2 粉体材料 3.2.1 对于粉体材料，按照每克粉体对应100mL体外矿化液的用量。 3.2.2 将计算好的体外矿化液加入到聚四氟乙烯瓶或玻璃锥形瓶中，封口，预热至 37℃，放入样品并置于37℃、100 rpm的恒温摇床中震荡。在规定时间取出样品，样品以去离子水和丙酮交替淋洗，之后置于电热恒温干燥箱中105℃干燥24h，得到矿化后的样品进行后续测试。 注∶若有需要，可收集上清液用于检测矿化相关离子的浓度变化。 4 样品测试与表征 4.1 扫描电子显微镜分析 按照JY/T 0584进行，对不同反应时间的样品表面及其矿化产物形貌进行观察，有针状或者叶片状钙磷矿化产物生成。通过比较不同浸泡时间的扫描电镜图，判断矿化产物HCA的生成量是否不断增加。 4.2 红外光谱分析 按照GB/T 6040进行，观察浸泡不同时间的矿化产物的特征吸收峰，并用来判断最终是否有低结晶度的HCA形成，并定性分析其生成。 4.3 X 射线衍射分析 按照《中华人民共和国药典》（2020年版 四部）通则中0451的X射线衍射法进行，对不同反应时间矿化产物进行分析，结合其特征衍射峰：JCPDS：2θ=25.9°（002），31.8°（211），39.8°（310），46.7°（222），49.5°（213），53.1°（004）进一步明确矿化产物种类以及结晶程度。