涂层抗凝血性能体外试验方法

【适用范围】 本文件规定了涂层抗凝血性能体外试验的总则、试验方法和报告。 本文件适用于通过强结合力均匀固定在材料或器械表面的抗凝涂层。 本文件不适用于能从表面快速洗脱或释放的涂层。 【主要技术内容】 5 试验方法 蛋白质吸附测试 5.1.1 概述 当血液与医疗器械接触时，器械表面会迅速的吸附上纤维蛋白原等血浆蛋白，吸附的血浆蛋白会进一步造成血小板的大量黏附，最终导致凝血的形成。因此，评估吸附在器械表面血浆蛋白的吸附情况，可作为判断涂层抗凝性能的重要指标。 5.1.2 方法一 5.1.2.1 原理 通过ELISA间接法，样品表面吸附一定量的纤维蛋白原（Fg）作为抗原，将吸附Fg的样品先与特异性的纤维蛋白原抗体结合，然后加入酶标记的二抗形成复合物，最后通过底物反应产生显色信号来检测样品上吸附的Fg的含量。 5.1.2.2 试验步骤 样品在以pH 7.4的缓冲液配置的Fg溶液中浸泡吸附1 h～4 h后，取出样品轻轻洗去表面未牢固吸附的Fg，置于容器中依次加入纤维蛋白原抗体和带有酶标记的二抗进行结合，然后加入显色剂和终止液，测试反应液在最大吸收波长下的吸光度值，通过与无涂层的同种材料样品比较，间接反映有无涂层样品对Fg吸附量的差异。 注：制备体积较大或较厚的涂层材料时，宜尽量减少切割面的暴露，且使Fg蛋白溶液完全覆盖试验样品。 5.1.3 方法二 5.1.3.1 原理 在碱性环境下，蛋白质分子中肽键与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。二喹啉甲酸（BCA）特异地与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 ?处的吸光度与纤维蛋白原（Fg）浓度呈线性关系，通过建立Fg浓度--吸光度标准曲线，可计算样品表面吸附的蛋白质浓度。 5.1.3.2 试验步骤 5.1.3.2.1 将 Fg 用 pH 7.4 的缓冲液配置成不同浓度的标准溶液，参照 BCA 蛋白浓度测定试剂盒的要求加入配置好的 BCA 工作液，37 ℃孵育 30 min 后，立即在 562 ?处测试吸光度值，以 Fg 浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线，采用线性方程进行拟合。 5.1.3.2.2 样品在 Fg-PBS 溶液浸泡吸附 1 h～4 h 后，取出样品轻轻洗去表面未牢固吸附的 Fg，置于容器中加入 BCA 工作液，37 ℃孵育 30 min 后，立即读取反应液吸光度值，带入标准曲线，计算得到蛋白浓度。通过与无涂层的同种材料样品比较，反映有无涂层样品对 Fg 吸附量的差异。 注1：不同材料会有不同的背景响应值，样品应进行未吸附Fg的测试获取背景数据。例如PVC、镍钛合金和Pebax等 材料采用本方法时背景值较大，在选择方法时宜结合材料特性充分考虑。 注2：制备体积较大或较厚的涂层材料时，宜尽量减少切割面的暴露，且使Fg蛋白溶液完全覆盖试验样品。 5.1.3.3 结果分析 按式（1）计算样品蛋白质的吸附量。 ?? = (??1 ? ??0) × ??······································································(1) 式中： Q——蛋白质吸附量，单位为μg）； c1——样品吸附的蛋白浓度，单位为μg/mL； c0——样品背景的浓度，单位为μg/mL； v——缓冲液体积，单位为mL。 5.1.4 方法三 5.1.4.1 原理 通过痕量标记蛋白的示踪技术来定量分析蛋白在基材表面上的准确吸附量。通过氯化碘（ICl）将125I阴离子氧化成为125I2单质，然后取代蛋白质酪氨酸残基苯环上羟基邻位的氢，从而将125I标记于蛋白质。通过测量吸附在样品表面的放射量来表征蛋白的吸附量。 5.1.4.2 试验步骤 将125I标记后的蛋白质溶液通过阴离子交换树脂柱以除去未反应的125I离子，测定125I标记的蛋白质溶液在280 ?处的吸光值，除以吸光系数后得到标记蛋白溶液的浓度。将标记蛋白溶液按比例与未标记蛋白溶液混合，作为 125I蛋白质吸附液。将待测样品浸入125I蛋白质吸附液中一定时间后，润洗并晾干，使用γ-计数器测定待测样品表面的放射量。同时测定已知蛋白质含量的125I蛋白质吸附液的放射量，从而定量表征样品表面蛋白质的吸附量。 5.2 血小板黏附试验 5.2.1 概述 在凝血形成过程中，血小板的黏附和聚集扮演了重要的角色。黏附在器械表面的血小板活化后会释放大量促凝物质，并发生形态的变化，加速血小板的聚集和活化，从而使凝血反应急剧扩大。因此评估器械表面黏附血小板的形态和数量，可作为判断涂层抗凝性能的重要指标。 5.2.2 试验步骤 样品或对照材料与新鲜的抗凝全血或富血小板血浆（PRP）37 ℃下接触孵育后用生理盐水轻轻洗去表面非黏附的血小板，宜采取包括但不限于以下方法对样品表面黏附的血小板进行观察和分析： a) 样品经乙醇梯度脱水、戊二醛固定、喷金后采用扫描电子显微镜（SEM）观察样品表面血小板的数量、分布和形态； b) 样品经固定、免疫组化染色、晾干后采用荧光显微镜观察样品表面血小板数量和分布； c) 采用细胞裂解液对样品表面黏附的血小板进行裂解，参照市售乳酸脱氢酶（LDH）活性浓度试剂盒的测试方法检测裂解液中 LDH 活性浓度，在样品之间间接比较血小板黏附的数量。 注1：与样品孵育后的全血或PRP也可进行血小板计数，比较样品接触前后的血小板的变化。 注2：宜使用健康成人新鲜血液进行试验，若使用其他动物血液，应验证其适宜性。 注3：宜优先采用与临床场景相似的动态条件进行试验，例如Chandler Loop系统模型。 5.3 凝血时间 5.3.1 概述 本方法适用于带肝素涂层的医疗器械。肝素通过对抗凝血酶的激活阻断凝血反应，导致凝血时间延长。因此，比较样品接触血液后凝血时间的变化，可以反映样品的抗凝效果。 5.3.2 试验步骤 按YY/T 1911方法制备血浆、兔脑磷脂和氯化钙溶液，按GB/T 16886.12的规定制备样品。试验样品和血浆直接接触，依次加入预热的兔脑磷脂和氯化钙溶液后，样品不取出，肉眼观察血浆中出现的冻状凝固物的时间（最长至5 min），用计时器以秒为单位记录。 注：也可使用凝血仪获得凝血时间测试结果。 5.4 体外血栓测试 5.4.1 概述 医疗器械和全血直接接触后会吸附或黏附各类血浆蛋白和血细胞等，激活凝血途径，最终形成血栓。 评估器械和全血接触后表面血栓的形成情况，可以反映样品的抗凝效果。 5.4.2 试验步骤 样品或对照材料与新鲜的全血37 ℃下接触孵育后用生理盐水轻轻涮洗，然后肉眼或显微镜观察器械表面形成的血栓情况，也可称量生成血栓的湿重或干重等指标。 注1：宜使用健康成人新鲜血液进行试验，若使用其他动物血液，应验证其适宜性。全血可使用：非抗凝人体全血、抗凝人体全血、抗凝人体复钙化全血等。 注2：宜优先采用与临床场景相似的动态条件进行试验，例如Chandler Loop系统模型。孵育时长的选择根据样品临床用途和试验目的设定。 6 报告 试验报告应包括但不限于以下内容： a) 样品的识别； b) 样品制备方法； c) 测试方法； d) 测试条件； e) 测试结果。