医疗器械表面肝素抗 Xa/Ⅱa 因子活性和含量试验方法

【适用范围】 本文件规定了带肝素抗凝涂层医疗器械表面肝素抗Xa/Ⅱa因子活性和含量试验的总则、试验方法和报告。 本文件适用于通过一定的方式结合在器械表面的含有肝素成分的涂层，其他肝素涂层种类亦可参照使用。 【主要技术内容】 5 试验方法 5.1 抗 Xa/Ⅱa 因子活性 5.1.1 原理 肝素与AT-Ⅲ形成复合物，抑制过量添加的Xa/Ⅱa因子的活性，发色底物与剩余Xa/Ⅱa因子特异性结合，水解释放对硝基苯胺（pNA），在405nm处的吸光度与反应体系中的肝素浓度成反比。 5.1.2 试验步骤 5.1.2.1 标准曲线的制作 使用按照《中华人民共和国药典》（2020年版 四部）配置的pH为8.4的三羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇6 000缓冲液配置不同浓度的肝素钠标准溶液，加入抗凝血酶溶液使肝素钠浓度在0 IU/mL～3 IU/mL范围内，然后加入Xa/Ⅱa因子溶液和发色底物溶液，37 ℃孵育2 min～20 min后，加入醋酸溶液终止反应，立即测量反应液在405nm处的吸光度值，以肝素钠浓度的对数值为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，采用线性方程进行拟合。 5.1.2.2 试验样品测试 取样品置于试管中，参照5.1.2.1步骤，将样品的吸光度值带入标准曲线，计算得到样品的肝素浓度。 5.1.3 结果分析 按式（1）计算样品肝素抗Xa/Ⅱa因子活性总量（Q1）： ??1 = ?? × ?? ···········································································(1) 式中： Q1——样品肝素抗 Xa/Ⅱa 因子活性总量，单位为 IU； C——样品肝素浓度，单位为 IU/mL； V——缓冲液体积，单位为mL。 5.2 肝素含量 5.2.1 方法一 5.2.1.1 原理 肝素在水溶液中由于其酸性基团的解离而高度带负电荷，甲苯胺蓝和肝素钠在水溶液中会发生静电结合，未被结合的甲苯胺蓝在最大吸收波长处的吸光度与肝素钠浓度呈线性关系。 5.2.1.2 试验步骤 5.2.1.2.1 标准曲线制作 将肝素钠用生理盐水或PBS缓冲液在0μg/mL～30μg/mL范围内配置成不同浓度的标准溶液，然后加入甲苯胺蓝溶液（0.002％～0.0002％，w/v），室温下孵育3 min～10min后测定甲苯胺蓝最大吸收波长处的吸光度值。以肝素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线，采用线性方程进行拟合。 5.2.1.2.2 试验样品测试 取带肝素涂层和无涂层的同种材料样品置于试管中，然后参照5.2.1.2.1步骤，将测试的吸光度值带入标准曲线，计算得到样品的肝素浓度。应进行无涂层的同种材料样品测试，扣除背景材料影响。 5.2.2 方法二 5.2.2.1 原理 在酸性条件下，利用亚硝酸钠的强氧化性降解涂层中的肝素分子使其氨基己糖结构脱氨并产生醛基，然后加入3-甲基-2-苯并噻唑酮腙（MBTH）与之发生化学反应，最后产生具有蓝色的MBTH偶联物，反应液最大吸收波长处的吸光度与肝素钠浓度呈线性关系。 5.2.2.2 试验步骤 5.2.2.2.1 标准曲线制作 将肝素钠用生理盐水或PBS缓冲液在0μg/mL～100μg/mL范围内配置成不同浓度的标准溶液，加入等体积的亚硝酸钠溶液和乙酸溶液37℃反应60 min以上，然后依次加入等体积的氨基磺酸铵溶液、MBTH和氯化铁溶液后，测试在628 nm～632 nm处的吸光度。以肝素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线，采用线性方程进行拟合。 5.2.2.2.2 试验样品测试 取带肝素涂层和无涂层的同种材料样品置于试管中，然后参照5.2.2.2.1步骤，将测试的吸光度值带入标准曲线，计算得到样品的肝素浓度。应进行无涂层的同种材料样品测试，扣除背景材料影响。 5.2.3 结果分析 按式（2）计算样品表面肝素含量（Q2）： ??2 = (??1 ? ??0) × ?? ·····································································(2) 式中： Q2——肝素含量，单位为μg； c0——无涂层样品背景浓度，单位为μg/mL； c1——涂层样品肝素浓度，单位为μg/mL； v——溶剂体积，单位为mL； 注：以重量单位表示肝素含量旨在客观定量描述涂层化学组成，并非关联肝素活性或抗凝性能。 6 报告 试验报告应包括但不限于以下内容： a) 样品的识别； b) 样品制备方法； c) 测试方法； d) 测试条件； e) 测试结果。