化妆品温和（无刺激）功效评价-斑马鱼胚胎尾鳍切口中性粒细胞测试方法

【适用范围】 本文件提供了利用斑马鱼胚胎评价化妆品温和（无刺激）性能的测试方法。 本文件适用于化妆品及其原料的温和（无刺激）功效评价。 【主要技术内容】 7 实验方法 7.1 受试生物 选用健康的3天大（受精后72h）野生型纯品系或中性粒细胞荧光标记的斑马鱼（Danio rerio）胚胎。 7.2 受试物准备 7.2.1 水溶性原料/产品：可用鱼胚胎培养液直接将受试物溶解配制成测试溶液。 7.2.2 非水溶性原料/产品：可选常用溶剂如甲醇、二甲基亚砜、乙醇等助溶。如将受试物和有机溶剂按1：1（重量g：体积mL）混匀，超声处理10min，然后加入鱼胚胎培养液配制成所需浓度，震荡30s。如有颗粒物质存在，则于6,500rpm 离心10min，取上清液进行测试。 驻留型产品测试浓度为1g/L，淋洗类产品测试浓度为0.01g/L。 7.3 测试步骤 测试流程可参考附录A图A.1。 7.3.1 损伤模型 使用三卡因溶液麻醉斑马鱼胚胎，于显微镜下用实验解剖刀在尾巴末端尾鳍起始处切个切口（附录B图B.1）。 7.3.2 测试分组 测试应设定模型对照组、刺激对照组和受试物组。如用到助溶剂，各测试组应含相同浓度的助溶剂。 模型对照组：随机挑选24尾损伤模型鱼胚胎至3cm培养皿中，暴露于5mL鱼胚胎培养液。 刺激对照组：随机挑选24尾损伤模型鱼胚胎至3cm培养皿中，暴露于5mL十二烷基硫酸钠溶液。 受试物组：随机挑选24尾损伤模型鱼胚胎至3cm培养皿中，暴露于5mL受试物溶液。 放置于28℃±1℃恒温箱中培养3h±0.25h。 于显微镜下观察鱼胚胎，一分钟内心脏没有跳动的鱼胚胎判定为死亡，统计鱼胚胎死亡数。 7.3.3 苏丹黑染色 如采用中性粒细胞荧光标记斑马鱼胚胎进行测试，不用进行苏丹黑染色，直接进行7.3.4结果观察和计算。如采用野生型斑马鱼胚胎进行测试，则进行下面苏丹黑染色。 首先，将每组试验鱼胚胎用多聚甲醛固定1h后，用PBST浸泡鱼胚胎3次，每次5min，然后用50%乙醇浸泡3min。 其次，用苏丹黑染色溶液对鱼胚胎进行室温染色1h后，用70%乙醇浸泡4次，每次5min，然后用PBST浸泡2次，每次5min。 最后，用漂白溶液浸泡鱼胚胎10min，如在试管里浸泡，则应保持盖子打开。然后用70%乙醇溶液浸泡5min，PBST浸泡1min，用清透液1浸泡15min，清透液2浸泡10min，再用PBST浸泡3min。 7.3.4 结果观察和计算 如采用中性粒细胞荧光标记斑马鱼胚胎进行测试，使用三卡因溶液麻醉斑马鱼胚胎，将鱼胚胎侧身摆放，于显微镜下对每尾鱼胚胎尾鳍损伤处进行拍照。 采用野生型斑马鱼胚胎进行测试，在苏丹黑染色完成后，将鱼胚胎侧身摆放，于显微镜下对每尾鱼胚胎尾鳍损伤处进行拍照。 对每尾鱼胚胎尾鳍切口位置（正方形区域）的中性粒细胞数目进行计数（见附录B图B.1；深色点即为染色的中性粒细胞）。按照式（1）计算中性粒细胞聚集促进率： 式中： S—受试物处理组鱼胚胎中性粒细胞数目的平均值，单位为个每尾（个/尾）； C—模型对照组鱼胚胎中性粒细胞数目的平均值，单位为个每尾（个/尾）。 对受试物处理组和模型对照组的中性粒细胞数目进行双尾T检验，取得p值。 8 实验可接受性标准 每批次测试均应设置刺激对照组，且刺激对照组的中性粒细胞数目显著(p<0.05)多于模型对照组。 9 结果评判 利用聚集促进率对产品的刺激性进行评价，评价规则见表1。 表1 聚集促进率与产品刺激性对应规则 聚集促进率 刺激性分类 聚集促进率≤0 温和（无刺激性） 聚集促进率＞0且p≥0.05 聚集促进率＞0且p＜0.05 有刺激性 有鱼胚胎死亡 强刺激性/腐蚀性 10 实验室能力验证 建议对附录C表C.1中的参考物质进行测试。十二烷基硫酸钠随着浓度增加，刺激性也逐渐增加，如选用的不是十二烷基硫酸钠分析纯，其温和（无刺激）、有刺激性和强刺激性/腐蚀性对应浓度会有所不同，可根据测试结果选择合适的浓度作为刺激对照组浓度。