松材线虫RPA分子检测技术规程

【适用范围】 本文件描述了松材线虫RPA分子检测、检测对象、检测流程、结果判定以及记录和归档的方法。 本文件适用于进出境植物检疫、国内植物检疫以及林业有害生物调查及其寄主植物和制品中携带松材线虫的分子检测鉴定工作。 【主要技术内容】 主要技术内容： 本技术的主旨是在恒温条件下实现松材线虫DNA的快速扩增，具体技术如下： （1）样品的制备：采用贝尔曼分离法或快速分离器分离线虫，亦可采用电钻直接钻取木屑； （2）样本DNA的提取：使用自主研发的提取试剂裂解样本，释放核酸； （3）加入独家设计的特异的分子探针、引物及样本核酸； （4）在ATP存在条件下，重组酶与引物结合形成蛋白-核酸复合物，并搜索配对的松材线虫DNA模板； （5）重组酶离开引物，并在DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。同时，SSB与置换出的单链DNA结合； （6）新合成的DNA链又可以作为模板进行下一轮扩增，从而实现指数式扩增； （7）通过配套核酸荧光检测仪实时采集信号，绘制荧光信号-时间曲线，计算Ct值，然后根据样品Ct值的大小及曲线的形状自动判定结果。 创新点： （1）目前市场上松材线虫检测时间平均在40分钟，此项技术大大缩短了松材线虫检测时间，在15分钟即可完成； （2）整个扩增过程在恒温环境下完成，不需要高额的硬件设备，普适性高； （3）检测准确，灵敏度可达10 copies/μl。