人羊膜间充质干细胞

【适用范围】 本文件规定了人羊膜间充质干细胞的技术要求、检验方法、检验规则、使用说明、标签、包装、储存、运输和废弃物处理要求。 本文件适用于人羊膜间充质干细胞的生产和检测。 【主要技术内容】 5.1 原材料和辅料 5.1.1 应符合T/CSCB 0001要求。 5.1.2 应建立供者细胞采集的供者评估与筛选标准、采集方法、运输标准和交接标准，保证供者和细胞的安全。 5.1.3 供体应筛查HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV和TP，并记录结果。 5.2 分离与培养方法 5.2.1 分离及提取 人羊膜组织剪碎至糜状，以胶原酶消化法分离人羊膜间充质干细胞。进行人羊膜间充质干细胞原代培养。 5.2.2 人羊膜间充质干细胞换液 根据细胞的生长情况换液。 5.2.3 人羊膜间充质干细胞传代 传代操作应密度适宜、及时、迅速。 5.2.4 人羊膜间充质干细胞冻存 冻存细胞程序降温后置液氮中保存。 5.2.5 人羊膜间充质干细胞复苏 取出冻存管进行快速融化，离心洗涤后进行培养。 5.2.6 人羊膜间充质干细胞制剂制备 人羊膜间充质干细胞溶液为均质状态，无絮状沉淀，细胞存活率≥90％。 5.3 关键质量属性 5.3.1 细胞形态 细胞贴壁培养时呈纺锤形和梭形的成纤维细胞态，形态均一。 5.3.2 染色体核型 正常核型应为46,XX或46,XY。 5.3.3 细胞存活率 未冻存细胞存活率≥90%且冻存复苏后细胞存活率≥70%。 5.3.4 细胞标志蛋白 CD105、CD73、CD90阳性率均≥95%；CD11b、CD19、CD31、CD34、CD45、HLA-DR阳性率≤2%。 5.3.5 免疫调节 经炎症因子（IFN-γ或者IFN-γ联合TNF-α）诱导后表达吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）。与T淋巴细胞共培养能抑制T淋巴细胞增殖及分泌IFN-γ、TNF-α。 5.3.6 三系分化 具有成骨、成脂、成软骨的分化潜能。 5.3.7 成瘤性 免疫缺陷动物（如小鼠）体内成瘤试验结果为阴性。 5.3.8 微生物 真菌、细菌、支原体、HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV、TP为阴性。 5.4 过程控制 5.4.1 扩增、冻存、复苏等过程控制应符合T/CSCB 0001要求。 5.4.2 细胞STR检测结果应与供体细胞保持一致。 6 检验方法 6.1 细胞形态 二维培养条件下，用明视场细胞显微镜进行观察。 6.2 染色体核型 按照《中华人民共和国药典》中“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程”项检验。 6.3 细胞存活率 按照附录A的方法检验。 6.4 细胞表面标志物 按照附录B的方法检验。 6.5 免疫调节 6.5.1 诱导IDO表达 按照附录C的方法检验。 6.5.2 抑制T淋巴细胞增殖 按照附录D的方法检验。 6.5.3 抑制T淋巴细胞分泌IFN-γ、TNF-α 按照附录E的方法检验。 6.6 三系分化 6.6.1 成骨分化 按照附录F的方法检验。 6.6.2 成脂分化 按照附录G的方法检验。 6.6.3 成软骨分化 按照附录H的方法检验。 6.7 成瘤性 按照附录I的方法检验。 6.8 微生物 6.8.1 真菌 按照《中华人民共和国药典》中“1101无菌检查法”项检测。 6.8.2 细菌 按照《中华人民共和国药典》中“1101无菌检查法”项检测。 6.8.3 支原体 按照《中华人民共和国药典》中“3301无菌检查法”项检测。 6.8.4 HBV 按照《全国临床检验操作规程》核酸法检验。 6.8.5 HCV 按照WS 213核酸法检验。 6.8.6 HIV 按照WS 293核酸法检验。 6.8.7 HTLV 按照《全国临床检验操作规程》核酸法检验。 6.8.8 EBV 按照《全国临床检验操作规程》核酸法检验。 6.8.9 HCMV 按照《全国临床检验操作规程》核酸法检验。 6.8.10 TP 按照WS 273核酸法检验。 7 检验规则