非洲猪瘟病毒（ASFV I 型毒株、ASFV II 型毒株混合或 ASFV I&II 型嵌合毒株）实时 荧光定量 PCR 检测技术规程

【主要技术内容】 1.ASFV荧光PCR引物探针设计与选择:下载我国流行的ASFV I型、II型及嵌合毒株的靶基因序列，1.依据ASFV基因分型的靶基因B646L通过软件分析设计各毒株的特异性探针，确保针对不同毒株的特异性和准确性。 2.敏感性质控样品制备：确定我国流行的ASFV I型、II型及嵌合毒株的参考毒株的B646L靶基因序列，分别构建各毒株靶基因的重组质粒，作为各毒株的敏感性质控样品，用于方法建立。 3.实验设计与优化:设置适当的起始模板量（低模板检测）、反应条件（如引物探针浓度、温度、反应时间等）以及通道串扰优化，以提高检测的灵敏度和准确性。 4.最佳临界值的确定:用国家标准《GB/T 18648-2020 非洲猪瘟诊断技术》筛选ASFV核酸阳性样品，再通过测序比对确认ASFV的基因型，制备背景明确的临床样品盘，用建立的多重荧光PCR方法检测临床样品盘，通过与标准方法比对，绘制ROC曲线，确定各毒株的检测临界值，以确保建立的方法特异性和敏感性与国家标准方法的符合率最高。 5.质量控制措施:包括对照组设置（如已知浓度的标准曲线）、重复实验（至少3次平行实验）、阴性和阳性对照验证等，确保检测结果的可靠性和一致性。 6.数据处理与分析:通过曲线拟合和定量计算工具（如Ct值比较、百分比阈值等）对检测结果进行分析，结合实时荧光信号生成定量数据。 7.形成ASFV荧光PCR检测技术规程：汇总材料，形成检测技术规程。