生牛乳中乳铁蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋 白的测定液相色谱-串联质谱法

【适用范围】 本文件规定了生牛乳中乳铁蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的液相色谱-串联质谱测定方法。 本文件适用于生牛乳中乳铁蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的测定。 【主要技术内容】 4 原理 试样中的乳铁蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白经酶解作用水解成特征性肽段，以液相色谱-串联质谱法测定目标蛋白的特征性肽段，基质匹配标准曲线外标法定量，计算试样中乳铁蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的含量。 5 试剂或材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯。 5.1 试剂 5.1.1 水：GB/T 6682，一级水。 5.1.2 碳酸氢铵。 5.1.3 二硫苏糖醇。 5.1.4 碘代乙酰胺。 5.1.5 乙酸。 5.1.6 胰蛋白酶：序列分析纯，活力单位≥4 500 U/mg，或性能相当者。 5.1.7 甲酸：色谱纯。 5.1.8 乙腈：色谱纯。 5.1.9 鸡蛋蛋清粉：食品级。 5.2 试剂配制 5.2.1 碳酸氢铵溶液（100 mmol/L）：称取0.79 g碳酸氢铵，用水溶解后稀释至100 mL。 5.2.2 二硫苏糖醇溶液（500 mmol/L）：称取0.771 g二硫苏糖醇，用碳酸氢铵溶液（100 mmol/L）溶解后定容至10 mL。 5.2.3 碘代乙酰胺溶液（500 mmol/L）：称取0.925 g碘代乙酰胺，用碳酸氢铵溶液（100 mmol/L）溶解后定容至10 mL。 5.2.4 乙酸溶液（1 %）：吸取0.1 mL乙酸，用水稀释并定容至10 mL。 5.2.5 胰蛋白酶溶液（100 μg/mL）：称取1 mg胰蛋白酶，用乙酸溶液（1 %）溶解后稀释至10 mL，现用现配。 5.2.6 甲酸溶液（0.1 %）：吸取1.0 mL甲酸，用水稀释并定容至1 000 mL。 5.2.7 甲酸乙腈溶液（0.1%）：吸取1.0 mL甲酸，加入乙腈稀释并定容至1 000 mL。 5.2.8 空白基质溶液：称取0.10 g鸡蛋蛋清粉，用水定容至50 mL备用。 5.3 标准品 5.3.1 乳铁蛋白标准品（CAS号：146897-68-9）：纯度≥95%，铁含量≤35 mg/100g，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。 5.3.2 α-乳白蛋白标准品（CAS号：9051-29-0）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。 5.3.3 β-乳球蛋白标准品（CAS号：9045-23-2）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。 5.4 标准溶液配制 5.4.1 乳铁蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白标准储备液（1 mg/mL）：分别称取10.0 mg乳铁蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白标准品，用水定容至10 mL。混匀，0~4 ℃下保存，可保存3个月。 5.4.2 混合标准中间液（200 μg/mL）：分别准确移取2.0 mL的乳铁蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白标准储备液于10 mL容量瓶中，用空白基质溶液稀释至10 mL，现用现配。 5.4.3 标准系列工作液：吸取适量的混合标准中间液，用空白基质溶液逐级稀释至1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、50.0 μg/mL、100.0 μg/mL和200.0 μg/mL标准系列工作液，现用现配。 5.5 材料 5.5.1 1.5 mL离心管：聚丙烯材质。 5.5.2 50 mL离心管：聚丙烯材质。 5.5.3 水相微孔滤膜：0.22 μm，聚醚砜材质。 6 仪器和设备 6.1 液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。 6.2 天平：感量0.01 g和0.01 mg。 6.3 冷冻离心机：转速≥10 000 r/min。 6.4 涡旋混合仪。 6.5 超声波仪。 6.6 恒温振荡箱或恒温振荡水浴锅。