标准摘要
【主要技术内容】 4 要求 生产场地 4.1.1 基本要求 环境应干净整洁、空气优良、通风良好、水源充足且符合GB5749生活饮用水卫生标准、排水畅通、电源充足、交通便利。 4.1.2 环境卫生要求 应符合NY/T528食用菌菌种生产技术规程的规定。 生产设施设备 4.2.1 厂房设置和布局 应符合NY/T528食用菌菌种生产技术规程的规定。 4.2.2 发酵间 应按照GB50073洁净厂房设计规范执行，地面应能防水、防腐蚀、防渗漏、防滑，易清洗，排水坡度1%-1.5%，排水沟必须是圆弧式不锈钢的明沟；墙角为圆角，墙壁和天花板应能防潮、防霉、防水、易清洗。 4.2.3 接种间 应按照GB50073洁净厂房设计规范执行，液体菌种接种间设置缓冲间；入口处设置洗手、车间设封闭式废物桶，安装排气管道或者排风设备，门窗应设置防蚊蝇纱网。 4.2.4 主要仪器设备 应配备水处理设备、液体菌种培养器、空气压缩机、空气过滤器、液体菌种接种器、高压蒸汽灭菌锅、蒸汽锅炉、净化工作台、恒温培养箱、恒温摇床、冰箱、显微镜、磁力搅拌机、磅秤、天平、 酸度计等。在经常停电的地方应自备电源（发电机）。 4.2.5 主要生产用具 应配备玻璃三角瓶、接种机、试管、量杯量筒、玻璃漏斗、培养皿、定量定性滤纸、精密pH试纸等生物实验室常规用品。 培养基质 原材料应符合NY 5099 无公害食品 食用菌栽培基质安全技术要求的规定。 生产品种 4.4.1 选用高产、优质、抗逆性强、商品性好的黑木耳品种，使用经省级以上农作物品种审定委员会登记的品种，并且从具有相应技术资质的供种单位引种且种性清楚。 4.4.2 菌种生产过程应符合NY/T528 食用菌菌种生产技术规程的要求。 5 液体菌种生产工艺 5.1 工艺流程 5.2.1 容器 使用18mm*180mm或20mm*200mm玻璃试管，试管应保持清洁、干燥。 5.2.2 培养基配方 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（简称PDA培养基）：马铃薯200g,葡萄糖20g，琼脂20g,水1000mL，PH值自然。 综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基（CPDA培养基）：马铃薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，琼脂20g，水1000mL，PH值自然。 5.2.3 灭菌 高压蒸汽灭菌，在121℃，0.11MPa的压力下，维持30min。 5.2.4 接种 在超净工作台上严格按无菌操作接种。接种完成后，在试管上注明菌种名称、接种时间。 5.2.5 培养 根据黑木耳菌种的生长要求，给予24℃-25℃的培养温度，保持空气相对湿度65%-75%，避光培养。 5.2.6 留样 菌种应留样备查，留样的数量应以每个批次母种3支。于4℃-6℃下贮存，贮存至该批菌种出第一潮耳。 制备摇瓶液体菌种 5.3.1 容器 采用1000ml的常规三角瓶，三角瓶应保持清洁、干燥。 5.3.2 培养基配方 葡萄糖3%，豆饼粉2%，玉米粉1%，酵母粉，磷酸二氢钾0.1%，碳酸钙0.2%，硫酸镁0.05%，PH值自然。 可溶性淀粉3%-6%，蔗糖1%，磷酸二氢钾0.3%，硫酸镁0.15%，酵母膏0.1%，PH值自然。 5.3.3 摇瓶培养基制作 按照摇瓶培养基配方称取原料，先称取豆饼粉和玉米粉，混合后用四层纱布包好扎紧，开水煮沸20min,捞出，用四层纱布过滤定容，加入其余的原料至溶解。 5.3.4 装液量 将制备好的培养基液装入三角瓶中，每瓶装量为400ml，用硅胶塞封口。 5.3.5 灭菌 同5.2.3高压蒸汽灭菌法。 5.3.6 接种 将灭菌后的培养基瓶冷却至30℃以下，在超净工作台内接摇瓶种，超净工作台常规消毒后，每瓶在液面接入0.5cm2斜面母种3块～5块，菌种块尽量少带培养基，使菌丝面朝上，菌种块必须漂浮在液面上，接种结束后塞好硅胶塞。 5.3.7 培养 将接种后的三角瓶放入25℃恒温箱中静止培养2天-3天，待接种块在培养液面生长到1cm时，将该三角瓶放在140转/分钟的回旋式摇床上震荡培养，在培养温度25℃、空气相对湿度65%～75%、避光条件下培养7天后制得摇瓶液体菌种。 制备液体菌种专用母种 5.4.1 容器 采用500ml的常规三角瓶，三角瓶应保持清洁、干燥。 5.4.2 专用母种配方 杂木屑77%，麸皮20%，红糖2%，石膏1%，料：水=1:1.3，PH值自然。 注：杂木屑、麸皮用20目筛子过筛，用过筛后的细碎木屑和麸皮。 5.4.3 专用母种培养基制作 按照专用母种培养基配方称取原料，将各组分干拌均匀后再加水反复翻拌，直至翻拌均匀。 5.4.4 装料量 将制备好的专用母种培养基装入500ml的三角瓶内，料面要压平、压实，每瓶装料量450ml,擦净瓶口，塞上硅胶塞封口。 5.4.5 灭菌 将装料的三角瓶放入高压锅内进行灭菌，在温度达到121℃、压力0.15MPa时开始计时，维持90min。待瓶内温度降至30℃以下是备用。 5.4.6 接种 在超净工作台内，用灭好菌的吸管将摇瓶液体菌种接入到灭过菌的专用母种培养基上，接种量10ml/瓶。接种完成后，在试管上注明品种名称、接种时间。 5.4.7 培养 同5.2.5黑木耳菌种培养法。菌丝长满即可备用。 5.4.8 贮藏 长满菌丝的专用母种当时不用，可放在4℃-6℃冰箱内储藏三个月，便于随时取用。 发酵罐检查与清洗 5.5.1 检查 检查罐上全部阀门、安全阀、压力表、密封垫、管线，要求完好，工作正常。 5.5.2 清洗 对罐体内外和全部阀门用流水进行冲洗，达到无死角、内壁无任何培养料残余物的清洁程度。 5.5.3 空消 培养罐初次使用、出现染菌、长期放置、更换品种时，都要求空消灭菌。有内置电加热棒的培养器加水至容积的80%加热至121℃，灭菌40min。用外源蒸汽灭菌的培养器，蒸汽压力达到0.11MPa～0.12MPa、温度121℃～124℃、灭菌40min。 液体菌种培养基配方 土豆10%；红糖1.5%；葡萄糖1%；麸皮4%；蛋白胨0.2%；磷酸二氢钾0.2%；硫酸镁0.1%；VB1：10mg/L;泡敌0.03%。 液体菌种培养基制作 按照液体菌种培养基配方称取原料，先称取麸皮，开水煮沸20min,用四层纱布过滤出麸皮，再放入土豆煮至“酥而不烂”，四层纱布过滤，加入其余的原料至溶解。 投料与定容 打开培养器的上料盖，将配制好的培养基，加适量的水，搅拌均匀，倒入培养器中，加水定容，培养基投料量为罐体总容积的70%-80%，然后拧紧上料盖。 培养器实消 开启蒸汽阀门对培养器夹层及内层加热，当压力达到0.05MPa时打开培养器的放气阀排放冷气，当放出的蒸汽变直时关闭放气阀。当培养器内蒸汽压力达到0.11MPa-0.12MPa,培养温度达到123℃时开始计时，维持40min后关闭蒸汽进气阀门，打开培养器排气阀门，使得培养器压力缓慢下降（培养器压力不能掉零），此时培养器灭菌结束。 注：计时开始时，中间和灭菌结束时需要对培养器进行排料操作。微开接种阀门，有少量气、料排出即可。每次排料时间3-5min，三次共排料3-5L。 冷却降温 培养基冷却是将灭菌结束后的培养基由123℃降至25℃的过程。打开冷水开关，利用循环冷却水进行冷却降温。在培养料灭菌最后一次排料后，微开培养器进气阀门，启动空压机，操作缓慢进行，使得之前通过过滤器的无菌空气通入培养器内。控制培养器排气阀门使培养器压力控制在0.04MPa 给培养器内加压，使培养器内维持负压，尽快使培养液降温至30℃以下。 专用种的并瓶 用1000ml的三角瓶盛装750ml的水，在121℃-126℃的高压条件下灭菌40min,待水温降至30℃以下时，在超净工作台内将专用母种在无菌条件下捣碎并倒入到无菌水瓶中，制成菌悬液。 接种 用带有手柄的内经略大于接种口的铁丝缠绕纱布，蘸上95%的酒精，套在接种口上点燃。关闭培养罐进气阀门，打开培养器排气阀，当培养器压力降至0.01MPa以下时，打开菌悬液瓶塞，在火焰上灼烧瓶口30-40秒，打开接种口盖，将菌悬液迅速倒入罐中，迅速盖好接种口盖，拧紧。取下火圈，用湿抹布扑灭。打开进气阀门向罐内通入新鲜空气。 液体菌种培养 接种结束后，微开排气阀门，是关押升至0.02MPa-0.04MPa，并检查培养温度和空气流量培养温度设定在25℃，通气量6L/min，通气压力0.06MPa。大多数黑木耳品种培养时间为72h-96h。接种24h以后，每隔12h可从接种口取样1次，观察菌种萌发和生长情况。 留样与检测 5.14.1 留样 摇瓶液体菌种样品；培养器灭菌后的空白培养基样品；培养过程中定期从培养器中取出的样品用作镜检和其它理化指标测定。上述样品放4℃冰箱内保存一周以上。 5.14.2 无菌检测 对上述留存样品应在无菌检测琼脂平板上划线培养，在28℃恒温培养2d-5d，每天观察菌落生长情况，弱化线上没有细菌、霉菌、酵母菌菌落生长，则表明该样品无杂菌。对留样样品应在取样后及时镜检，确定菌丝生长发育状态和有无杂菌污染。 液体菌种放罐指标 5.15.1 经镜检和其它理化指标等方法检验质量合格即可放光接种。培养温度调节24℃-26℃。 5.15.2 感官指标见表1 项目 指标 菌液色泽 球状菌丝体呈白色，滤液呈棕色 菌液形态 菌液稍粘稠，有大量片状或球状菌丝体悬浮、分布均匀、不迅速分层，菌液不混浊。 菌液气味 有食用菌液体培养液特有的香气，无异味，乳酸、臭味等。培养器排气口气味正常，无明显改变。 表1 感官指标 5.15.3 理化指标见表2 表2 理化指标 项目 指标 PH值 在该品种正常范围内 菌丝湿重（g/100ml） >8 显微镜下菌丝形态和杂菌鉴别 可见食用菌菌种液体培养基中特有的菌丝形态，球状和丛壮菌丝大量分布，菌丝粗壮，菌丝内原生质分布均匀、染色剂着色深；无霉菌菌丝、酵母和细菌菌体。 留存样品无菌检查 有食用菌菌丝生长，划痕处无霉菌、酵母菌、西菌菌落生长。 贮存 5.16.1 摇瓶液体菌种保存方法 摇瓶液体菌种用牛皮纸包好，放4℃的温度下可保存5d-7d。 5.16.2 培养罐液体菌种保存方法 15℃-20℃室温可保存1d-2d。