基因组健康评价技术规范

【适用范围】 基因组稳定是健康促进、利好公众健康素质的基础遗传学要素。基因组损伤是基因组健康受到胁迫的生物学标识。 本文件规定了人体基因组损伤微创检测的细胞分子生物学原理与技术、操作规范。 本文件适用于以人体基因组健康评价为基础的遗传健康咨询，为构建健康管理、健康生活方式和公共卫生策略为特征的“零级预防”提供科学依据。 【主要技术内容】 1 微创外周静脉血取样：采样需经伦理审查和知情同意，受检人应需提供近三个月内的HBV、HCV、HIV和梅毒检测报告，上述任一病原体阳性者暂不参与本项健康评价分析。资质人员以肝素钠抗凝采集3ml，48小时内完成淋巴细胞分离培养、核基因组DNA提取。 2 淋巴细胞培养及制片 2.1 培养基质量要求：淋巴细胞培养使用标准RPMI1640培养基，含10%胎牛血清、2mM L-Glu、30μg/mL植物血球凝集素、1mM丙酮酸钠和100 IU/mL双抗，无菌分装，4℃避光保存，一周内使用。 2.2 淋巴细胞分离和计数质量要求：外周静脉血样于室温（15-28℃）下经HBSS稀释根据淋巴细胞分离液说明分离出淋巴细胞，HBSS清洗三次，1000rpm离心10min，计数。 2.3 细胞培养、细胞质分裂阻断与制片：将淋巴细胞接种于含≦800μL RPMI1640培养液的10ml圆底无菌试管中使其终浓度达到0.5×106个/mL，37℃、5% CO2培养箱中培养44小时，4.5μg/ml细胞松弛素B阻断细胞质分裂28小时，淋巴细胞分离及培养全程无菌操作。培养毕以涂片离心机制片；常规固定、染色及封片。 3 端粒长度分析：取6.1全血利用天根生化科技（北京）有限公司基因组DNA提取试剂盒（血液/细胞/组织）提取核基因组DNA，以RT-qPCR标准曲线法测量平均端粒长度。 3.1 标准品制备：以14个TTAGGG重复序列制备端粒标准品，度量样本端粒总长度，选单拷贝基因36B4序列制备单拷贝基因标准品，度量样本基因组倍数。 3.2 平均端粒长度分析：设定RT-qPCR标准曲线程序，RT-qPCR反应结束后，依据标准曲线得到目标样本的端粒总长度T（kb/reaction）和基因组拷贝数S（基因组拷贝数/reaction），二者的比率（T/S）即为样本单个基因组的端粒总长度（TL/diploid genome，Kb），除以染色体总数后得到样本的平均端粒长度（Kb）。 4 基因组损伤判断标准 4.1 染色体损伤：以细胞松弛素B胞质阻断的双核细胞微核、核质桥和核芽频率综合评判，受检个体的染色体损伤率位于相同年龄性别组秩的前1/3即提示基因组损伤的高水平。 a）双核细胞判断标准：被检细胞须为双细胞核、具有完整核膜，两个细胞核位于同一细胞质范围内；双核细胞中的两个细胞核大小均等，着色深浅和折光度基本一致；细胞质边界完整，与相邻细胞界限清晰。 b）双核细胞微核判断标准：双核细胞中的微核的直径通常为主核的 1/16～1/3，与主核的着色深度基本一致。 c）双核细胞核质桥判断标准：位于同一细胞质之中的二个细胞核之间的丝状连接，直径不超过主核直径的 1/4，其着色特征应与主核相一致。 d）双核细胞核芽的判断标准：双核细胞中的核芽与微核有相似的形态和着色特征，T/YEMS 01-2023 但以小柄与主核相连。 4.2 端粒长度异常评判：不同个体之间端粒长度变异范围较大，但具有个体特异性，同一个体淋巴细胞在间隔30~60天的两次平均端粒长度若出现显著差异，指示端粒长度的异常变化，异常改变的幅度与基因组损伤程度呈正比。 5 基因组损伤评判质控 5.1 外周血抗凝取样后需在48小时之内完成淋巴细胞分离并立即进行细胞培养。 5.2 细胞制片后需双盲显微分析，1000倍放大观察计数各个基因组损伤标志出现千分率，显微影像和数据信息均需准确留档备查。 5.3 端粒长度数据有效性：每个目标样品系统生成的值只有落在RT-qPCR标准曲线生成的直线范围内方有效，样品Ct值的标准误﹤0.5Ct（CV﹥5%）。 5.4 细胞分离、培养、收集、制片及分析过程的原始记录保存时间不低于10 年。