禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重实时荧光定量RT-qPCR检测方法

【适用范围】 本文件规定了禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）H5、H7、H9亚型多重实时荧光定量RT-qPCR检测的试剂与材料、仪器与设备、实验前准备、操作步骤、结果判定等内容。 本文件适用于家禽及野禽的组织、鸡胚尿囊液、排泄物、分泌物及环境样品中禽流感病毒M基因、H5、H7、H9亚型的核酸检测。 【主要技术内容】 根据禽流感病毒共有基因特定的序列，合成一对特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。探针的5＇端和3＇端分别标记不同的荧光素，如5＇端标记 FAM 荧光素，它发出的荧光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团(用 R 表示)，3＇端一般标记 TAMRA 荧光素，它在近距离内能吸收5＇端报告荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团（用Q表示）。 当 PCR 反应在退火阶段时，一对引物和一条探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到R所发出的荧光信号；当PCR反应进行到延伸阶段时，Taq酶在引物的引导下，以四种核苷酸为底物，根据碱基配对的原则，沿着模板链合成新链；当链的延伸进行到探面结合部位时，受到探针的阻碍而无法继续，此时的Taq酶将探针水解成单核昔酸，消除阻碍，与此同时标记在探针上的R基团游离出来被检测仪所接收；在Taq酶的作用下继续延伸过程合成完整的新链，R和Q基团均游离于溶液中，仪器可继续检测到R所发出的荧光信号。