香菇液体菌种工厂化制棒技术规程

【适用范围】 本标准规定了香菇液体菌种工厂化制棒的术语和定义、生产条件、培养基质、工艺流程、液体菌种生产、菌棒工厂化生产及生产档案。 本标准适用于香菇液体菌种工厂化制棒。 【主要技术内容】 香菇液体菌种工厂化制棒技术规程 1 范围 本标准规定了香菇液体菌种工厂化制棒的术语和定义、生产条件、培养基质、工艺流程、液体菌种生产、菌棒工厂化生产及生产档案。 本标准适用于香菇液体菌种工厂化制棒。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。 GB 150 压力容器 GB 3095 环境空气质量标准 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂 GB/T 5483 天然石膏 GB 5749 生活饮用水卫生标准 GB/T 12728 食用菌术语 GB 19170 香菇菌种 GB/T 30768 食品包装用纸与塑料复合膜、袋 GB 50073 洁净厂房设计规范 NY/T 119 饲料用小麦麸 NY/T 528 食用菌菌种生产技术规程 NY/T 1935 食用菌栽培基质质量安全要求 NY/T 2375 食用菌生产技术规范 NY/T 3415 香菇菌棒工厂化生产技术规范 DB33/T 1327 香菇工厂化生产技术规程 3 术语和定义 GB/T 12728、GB 19170、NY/T 3415 和DB33/T 1327 界定的以及下列术语和定义适用于本标准。 摇瓶菌种（一级种） 原始母种活化后，在三角瓶内培养的第一代液体菌种。 原种罐菌种（二级种） 一级种转接至小型专用罐内扩大培养的第二代液体菌种。 栽培种罐菌种（三级种） 一级或二级种接入栽培种罐工业化培养的生产用液体菌种。 长菌棒液体菌种接种工艺 按无菌接种要求，采用集自动传输、打孔、液体菌种灌注、自动套袋等功能于一体的长菌棒高效接种工艺。 接种量 接入培养基、料棒内的液体菌种数量或比例。 4 生产条件 场地要求 环境洁净，周围无空气、水源、土壤的污染源，给排水及供电方便，场地环境应符合GB 3095与NY/T 528的规定。 厂区布局 设室外堆料场、仓库、搅拌区、装袋区、灭菌区、冷却区、接种区（含摇瓶菌种培养室、原种罐与栽培种罐菌种培养室）、菌棒培养区等，各功能区彼此独立又相互衔接，并做到人流与物流分离、有菌区与无菌区隔离。 厂区布局应符合NY/T 528、NY/T 2375与 NY/T 3415的要求，其中冷却区、接种区按GB 50073的要求建造。 设施设备 配备与菌棒培养区规模相适宜的液体菌种培养基配制室、摇瓶菌种培养室、培养罐菌种培养室，及超净工作台、生化培养箱、抽滤瓶或三角瓶、培养罐、磁力搅拌器或摇床、空气压缩机、压缩空气储气罐及空气过滤系统、水处理设备、自动/半自动装袋机、环保蒸汽锅炉、高压蒸汽灭菌器、液体菌种接种机、培养环境控制系统等设施设备，压力容器应符合GB 150的要求。空气过滤系统包括冷冻干燥机、吸附式干燥机、空气过滤器、恒温机等。供电不稳地区，应配备备用电源（发电机）。 5 培养基质 液体菌种基质 马铃薯、麸皮、玉米粉、面粉、豆粕粉等原辅料要求新鲜、无虫、无霉、无异味，无有毒有害物质。 麸皮、玉米粉、豆粕粉等物料需经细粉碎，颗粒大小80目～100目，麸皮、玉米粉等原料应符合NY/T 1935的规定。生产用水应符合GB 5749的规定。 料棒基质 杂木屑、麸皮等原辅料要求新鲜、无虫、无霉、无异味，无有毒有害物质，杂木屑宜选不含芳香类抑菌物质的阔叶硬质树种加工。生产用水应符合GB 5749的规定，石膏应符合GB/T 5483的规定，麦麸应符合NY/T 119的规定，其他原料应符合NY/T 1935的规定。 6 工艺流程 香菇液体菌种工厂化制棒工艺流程见图1。 图1 香菇液体菌种工厂化制棒工艺流程图 7 液体菌种生产 品种选择 宜选用优质、高产、抗逆性强、商品性好且种性稳定的香菇品种，应从具备菌种生产经营资质的主体购买。引进菌种需进行适应性出菇试验验证。 母种生产 母种配方及生产操作流程应符合NY/T 528的要求。保存菌种需经活化和验证后使用，母种质量应符合GB 19170的规定。 摇瓶菌种生产 7.3.1 培养基配方 推荐培养基配方见附录A.1.1。 7.3.2 培养基配制 按液体培养基配方配制，装入摇瓶中，混合均匀，装液量为摇甁容量的30%~40%。 7.3.3 灭菌 将分装好的摇瓶放入灭菌锅内，蒸汽压力升至0.1 MPa～0.12 MPa，恒压维持25 min～30 min。 7.3.4 冷却 灭菌结束后，摇瓶冷却至28 ℃以下待用。 7.3.5 接种 在无菌条件下，用接种针挑取20～25块绿豆大小（1～2）mm×（1～3）mm的母种块迅速转接于摇甁内。 7.3.6 培养 接种后，搅拌或振荡培养，培养室温度控制23 ℃～25 ℃，搅拌培养转速300 r/min～700 r/min，振荡培养转速120 r/min～150 r/min，培养8 d～10 d。 7.3.7 菌种质量要求 培养液澄清透明、无异味；镜检无杂菌、菌丝形态正常；菌丝体密集，不低于整个培养液80%。 原种罐与栽培种罐菌种生产 7.4.1 罐体检查与空消 罐体初次使用、出现杂菌、长期闲置、更换品种等情况出现其一时，应检查罐体阀件等各部位有无泄漏情况，并空消。蒸气压力0.11 MPa～0.12 MPa，121 ℃～123 ℃，维持40 min。 7.4.2 培养基配方 推荐培养基配方见附录A.1.2。 7.4.3 投料 用水将配方原料搅拌均匀加入罐体，装液量为罐体容量的70%～80%，同时加入0.03%～0.05%消泡剂，通入空气搅拌1 min～2 min，混合均匀，拧紧上料口盖，气密性检查通过后开始灭菌。 7.4.4 灭菌 罐体内培养基灭菌蒸气压力0.11 MPa～0.12 MPa，121 ℃～123 ℃，灭菌过程保持排气阀微开，500L以下的中小型罐维持40 min～60 min，500 L～1000 L罐维持90 min～120 min。空气过滤器灭菌要求维持20 min～30 min，期间需进行间隙性排水，管路要求同步灭菌。 7.4.5 冷却 灭菌结束后，关闭蒸汽进气阀，同时缓慢打开罐体培养液内层排气阀进行降压，待压力接近零时及时向培养层内通入无菌空气，并始终维持罐压0.03 MPa～0.05 MPa，防止负压倒吸空气导致培养液污染。排管或夹层内通入冷水降温，待培养液温度降至25 ℃以下时，停止降温。 7.4.6 接种 将摇瓶和罐体接种管口表面用酒精消毒，接种口套上火焰圈，调节进排气阀，维持罐压至0.01 MPa～0.02 MPa。在火焰保护下，全开接种阀，将摇瓶菌种注入培养罐，关闭接种阀，撤除火焰圈，调节罐压0.03 MPa～0.05 MPa。建议接种量：摇甁菌种接原种罐0.5%～1.5%，原种罐菌种接栽培种罐 5 %～10 %。 7.4.7 培养 培养温度控制在23 ℃～25 ℃，根据菌丝生长情况，适时调节进气阀和排气阀，维持罐压0.03 MPa～0.05 MPa，培养6 d～8 d。 7.4.8 菌种检测 感官检验 观测菌丝形态、色泽、气味、菌丝量等，通过显微镜观察菌丝体锁状联合等显微形态。 霉菌检验 按照无菌操作从取样阀取少量培养液，接种于GB/T 4789.28中规定的PDA培养基中，置于 28 ℃～30 ℃恒温培养48 h，采用显微镜和感官观察菌丝生长状况及有无杂菌污染。若出现白色以外的杂色者，或有异味者为霉菌污染物，必要时进行水封片镜检。 细菌检验 按照无菌操作从取样阀取少量疑有细菌污染的培养液，接种于GB/T 4789.28中规定的营养肉汤培养液中，置于28 ℃～30 ℃恒温培养24 h～48 h，观察培养液是否浑浊。培养液浑浊，为有细菌污染；培养液澄清，为无细菌污染。 酸碱度测定 取样用pH计或pH试纸测定菌液酸碱度。 菌丝湿重测定 称取10 mL的培养液，经3000 r/min～4000 r/min 离心10 min～20 min，倒出上清液，称量菌丝湿重。 抽样检测 接种前1d～2 d对料液进行取样检查，检测形态、色泽、气味、菌液比，必要时进行显微镜检。 7.4.9 原种罐和栽培种罐菌种质量要求 液体菌种质量要求见表1。 表1 液体菌种质量要求 项 目 要 求 感官指标 菌液状态 菌丝片段均匀悬浮于液体中，不分层，菌液体积比达80%以上，菌球大小适宜。 菌液色泽 澄清透明呈浅黄色，菌丝球或菌丝片段呈白色或灰白色。 菌液气味 罐体排气口有香菇培养液特有的香气，无酸、臭等异味。 显微形态 菌丝健壮，无空泡，有明显锁状联合，无杂菌。 理化指标 菌液pH值3.5～4.5 ；菌丝湿重0.1 g/mL～0.2 g/mL。 8 菌棒工厂化生产 料棒制作 8.1.1 培养料配制 配方 推荐培养料配方见附录A.2。 拌料 根据计划生产数量和配方称取各原辅料，按照木屑、麦麸、木屑、麦麸、白糖、石膏的顺序将称重后的各种原辅料倒入搅拌机内，在未加水前充分拌匀10 min～15 min。干料搅拌均匀后，加水充分拌匀后使含水量达到52%～57 %，pH值6.0～6.5。 8.1.2 装袋 装袋机械 根据企业生产规模，定制集自动拌料、自动分料、自动套袋、装袋扎口、料棒收集等功能于一体的全自动装袋流水线。 栽培袋 外袋宜选用15 cm×55 cm或17 cm× 58 cm规格的聚乙烯折角筒袋，应符合GB/T 30768的规定；内袋宜选用15 cm× 50 cm或17 cm× 53 cm规格的免割保水膜袋，应符合NY/T 1935的规定。选用栽培袋需与装袋机套筒、培养架等设施相匹配。 质量要求 应用液体菌种接种的料棒含水量原则上比常规料棒少0.1 kg/棒，即筒袋规格15 cm×55 cm的料棒重1.9 kg～2 kg/棒；17 cm× 58 cm的料棒重2.8 kg～2.9 kg/棒。采用高压蒸汽灭菌，料棒需打孔贴透气膜。 8.1.3 灭菌 建议采用微压、高压灭菌，微压蒸汽灭菌料温宜4 h内升至105 ℃～110 ℃，保持8 h～10 h；高压蒸汽灭菌料温宜4 h内升至118 ℃～121 ℃，保持3 h～4 h，灭菌器内温度降到70 ℃以下出料。料棒制作完成后应及时灭菌，在灭菌器（柜）排尽冷空气并达到相应温度时开始计时。 8.1.4 冷却 料棒在预冷室降温至60 ℃～65 ℃后，移入事先已清洁的强冷室，6 h～8 h后，表面温度降到 20 ℃（料温22 ℃～26 ℃）为宜。 菌棒生产 8.2.1 接种 准备工作 接种前对接种室进行彻底清洁、消毒，室内温度调至18 ℃～22 ℃，湿度70%以下。接种人员应更换工作服及鞋帽进入接种室，用75%酒精擦拭双手消毒。 操作方法 采用长菌棒液体菌种接种工艺进行接种，“打孔—接种—套袋”一体化自动化操作，每棒5穴～6 穴，接种量15 mL/穴～20 mL/穴。 8.2.2 发菌培养 培养室 培养室应干净、干燥、通风、避光，使用前1 d～2 d进行清洁消毒处理。 环境调控 培养室温度控制24 ℃～26 ℃，菌棒中心温度不超过26 ℃；空气相对湿度60%～65%、CO2浓度低于3000 ppm。 发菌检查 菌棒培养7 d后，检查萌发定植及发菌情况，发现污染及时拣出进行无害化处理。 8.2.3 增氧管理 菌棒培养10 d～15 d，菌圈直径达6 cm～8 cm时脱去套袋；菌丝满棒时间25 d～30 d，满棒后10 d左右，使用刺孔机进行刺孔增氧，每棒刺孔45个～60个。 8.2.4 转色后熟 菌棒刺孔后排放至培养架上，间距2 cm～3 cm，控制温度22 ℃～24 ℃、空气相对湿度70%～80%、CO2浓度低于1600 ppm。 8.2.5 菌棒质量要求 菌棒质量要求见表2。 表2 菌棒质量要求 指标 要求 菌龄 不同品种（菌株）应达到其说明书中要求的菌龄。 外观 菌棒瘤状体分布均匀，转色占菌棒85%左右，呈茶褐色虎斑状且带有白点。 表2 菌棒质量要求（续） 指标 要求 手感 有弹性，无生硬感，不断棒。 气味 具有香菇菌丝特有的香味，无异味。 8.2.6 菌棒检测方法 菌棒检测方法见表3。 表3 菌棒检测方法 方法 要求 镜检 以每一培养罐液体菌种生产的菌棒为1批次。随机抽取每批次生产菌棒5～10棒进行镜检，菌丝粗壮、洁白，锁状联合明显。 催蕾试验 菌棒抽样在适宜的环境条件下进行催蕾处理，5 d～7 d后正常现蕾。 抽样检查 随机抽取1/1000菌棒，肉眼观察无杂菌及病虫害。 9 生产档案 母种、摇瓶菌种、原种罐菌种、栽培种罐菌种及菌棒生产的每个环节都要有详实的记录，记录内容见附录B。生产记录归档保存2年以上。 附录A （资料性） 培养基配方 A.1 液体菌种培养基配方 摇瓶菌种 配方1：马铃薯250.0 g、玉米粉1.0 g、葡萄糖25.0 g、蛋白胨2.0 g、酵母浸膏6.0 g、磷酸二氢钾3.0 g、硫酸镁1.5 g、消泡剂0.2 mL，水1000 mL，pH 6.0～6.5； 配方2：豆粕粉20.0 g、马铃薯淀粉10.0 g、葡萄糖30.0 g、磷酸二氢钾3.0 g、硫酸镁1.5 g、维生素B1 5.0 mg、消泡剂0.2 mL，水1000 mL，pH 6.0～6.5。 原种罐与栽培种罐菌种 配方1：麸皮5.0 g、面粉5.0 g、玉米粉3.0 g、酵母浸膏2.0 g、白砂糖18.0 g、羧甲基纤维素钠0.8 g、磷酸二氢钾1.0 g、硫酸镁0.5 g，水1000 mL，pH 6.0～6.5； 配方2：豆粕粉10.0 g（磨浆）玉米粉 10.0 g（磨浆）、麦麸10.0 g（磨浆）、葡萄糖20.0 g、酵母膏 4.0 g、磷酸二氢钾1.0 g、硫酸镁0.5 g，水1000 mL，pH 6.0～6.5。 A.2 菌棒培养基配方 杂木屑78%、麦麸20%、白糖1%、石膏（或碳酸钙1%。根据不同品种可适当优化调整。