液体菌种生产段木灵芝技术规程

【主要技术内容】 液体菌种生产段木灵芝技术规程 1 范围 本标准规定了液体菌种生产段木灵芝的术语和定义、基本要求、液体菌种制备、栽培技术、病虫害防治、档案管理等技术要求。 本标准适用于液体菌种生产段木灵芝。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。 GB 3095 环境空气质量标准 GB 5084 农田灌溉水质标准 GB 5749 生活饮用水卫生标准 GB/T 12728 食用菌术语 GB 15618 土壤环境质量 农用地土壤污染风险管控标准 GB/T 29344 灵芝孢子粉采收及加工技术规范 NY/T 528 食用菌菌种生产技术规程 NY/T 5010 无公害农产品种植业产地环境条件 NY 5099 无公害食品 食用菌栽培基质安全技术要求 DB33/T 985 段木灵芝生产技术规程 3 术语和定义 GB/T 12728界定的以及下列术语和定义适用于本标准。 灵芝 指多孔菌科灵芝属(Ganoderma)真菌的赤芝Ganoderma lingzhi.或紫芝Ganoderma sinense 。 段木料棒 指段木经装袋、灭菌后的段木料袋。 菌木棒 指经接种后长有灵芝菌丝的段木料袋。 空罐灭菌 指对尚未加水投料的空发酵罐进行蒸汽灭菌。 实罐灭菌 指对投料后的发酵罐进行高压蒸汽灭菌。 摇瓶菌种 指通过三角瓶等容器振荡培养的液体菌种。 一级罐菌种 指摇瓶菌种转接到发酵罐中用于扩大培养的液体菌种。 二级罐菌种 指一级罐菌种接入发酵罐培养并直接用于生产接种的液体菌种。 4 基本要求 卫生要求 4.1.1 人员 工作人员应该保持个人卫生，进液体菌种发酵、接种车间必须穿戴经灭菌处理的工作服、口罩、鞋、帽。 4.1.2 环境 生产环境按 NY/T 528的要求。空气质量符合GB 3095规定。土壤环境符合GB 15618的规定。生产用水符合GB 5749规定。灌溉用水符合GB 5084规定。 设施设备 ---宜配备培养基制作、发酵培养、灭菌、冷却、接种、培养贮存、段木加工与装袋等专用场所，大小匹配、布局合理。其中发酵培养、冷却、接种、培养贮存区具备空间温度、湿度控制系统。 ---应配有液体菌种培养器、液体菌种接种器、洁净空气系统、高压蒸汽灭菌系统、超净工作台、恒温回旋式振荡器、恒温培养箱、冰箱、显微镜、天平、酸度计等相关设施设备。 5 液体菌种制备 工艺流程 工艺流程见图1。 图1 灵芝液体菌种生产工艺流程 菌种选择 选择种性稳定，抗逆性强的灵芝栽培品种。母种按NY/T 528要求生产。 摇瓶菌种制备 5.3.1 培养基配方 按1000 mL计。 配方一：葡萄糖20 g，玉米粉3 g，蛋白胨2 g，豆粕10 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁0.5 g。 配方二：葡萄糖20 g，玉米粉10 g，酵母粉5 g，蛋白胨3 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁0.5 g。 5.3.2 灭菌 培养基装入三角瓶中，装液量为1/4～1/3，封口后移至高压灭菌锅中，保持0.105 Mpa～0.125 Mpa压力下30 min。 5.3.3 接种 冷却至30 ℃以下，在无菌条件下接入母种。 5.3.4 培养 在24 ℃～26 ℃、160 r/min～180 r/min条件下振荡培养7 d～8 d。 5.3.5 摇瓶菌种要求 菌种外观澄清透明不浑浊，无杂菌、无异味；菌丝体密集、均匀悬浮于液体中不分层。 一级罐和二级罐菌种制备 5.4.1 发酵罐清洗 发酵罐使用前用水对罐体和管路进行清洗，并检查发酵罐阀门的密封性。 5.4.2 空罐灭菌 在培养基装入前，应对罐体、管路、过滤器进行蒸汽灭菌，保持罐内0.105 MPa～0.125 Mpa压力下灭菌30 min～40 min。 5.4.3 培养基制备 培养基原料应符合NY/T 5099要求，按1000 mL计。 配方一：豆粉10 g、玉米粉5 g、蛋白胨2 g、白糖8 g、葡萄糖10 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁0.5 g。 配方二：豆粉20 g、蛋白胨2 g、葡萄糖18 g、硫酸铵2 g、磷酸二氢钾1 g、氯化钠2.5g。 5.4.4 实罐灭菌 用水将配方原料搅拌均匀后加入罐体，装液量应小于罐体容积的70%，并加入液体培养基重量 0.03%～0.05%的消泡剂，保持罐内0.105 MPa～0.125 Mpa蒸汽压力下灭菌90 min，空气过滤器灭菌保持20 min～30 min，期间需进行间隙性排水。 5.4.5 接种 待液体培养基冷却至28℃以下，一级菌种罐接种时，在火焰保护下接入摇瓶菌种，接种量为培养基重量的0.1%～0.3%；二级菌种罐接种时，由一级菌种罐通过管路接入二级菌种罐，接种量为培养基重量的5%～8%。 5.4.6 菌种培养 在罐压0.02 MPa～0.08 MPa，温度 24 ℃～27 ℃，培养5 d～8 d。前2天通气量0.5 V/V·min～1.0 V/V·min，中后期通气量1.0 V/V·min～1.5 V/V·min。 5.4.7 液体菌种检测 感官要求 感官指标符合表1的规定。 表1 灵芝液体罐菌种感官要求 感官指标 要 求 菌液色泽 菌丝球或菌丝片段呈白色，菌液呈浅棕色 菌液形态 菌液稍粘稠，有大量菌丝球或菌丝片段悬浮，分布均匀，不迅速分层，菌液不浑浊 菌液气味 有灵芝液体培养时特有的香气，无酸、臭等异味，发酵罐排气口气味正常，无明显改变 显微镜下 菌丝形态 可见灵芝菌丝粗壮，分枝密度高，可见锁状联合，无杂菌 霉菌检验 按照无菌操作取样，将样液接种于PDA斜面或培养皿培养基上，于28 ℃恒温培养2 d～5 d，借助感官观察与显微镜观测菌丝生长状况和有无霉菌污染，必要时进行水封片镜检。 细菌检验 将样液接种于营养肉汤培养基中，于28 ℃恒温培养48 h，观察培养基是否变浑浊带臭味。 6 栽培技术 栽培季节 宜在11月中下旬～翌年1月上旬制棒接种，3月下旬～4月下旬排场，5月下旬出芝。采收子实体的品种9月采收；采收孢子粉的品种，7月上旬套筒，9月下旬～10月上旬采收孢子粉和子实体。 菌木棒制备 6.2.1 树种选择 宜选择壳斗科的麻栎、青冈等阔叶树种，也可选择杜英科、金缕梅科等阔叶树种。 6.2.2 装袋 将原木截成20 cm～30 cm的木段，剔去尖角和毛刺，装入折径宽30 cm～36 cm，长60 cm～70 cm，厚0.006 cm～0.008 cm的聚乙烯筒袋。每袋视段木粗细可装1根～5根段木，重量7.0 kg～11 kg。装段木时防止袋子破损。袋子两端扎绳，或一端密封、另一端扎绳。 6.2.3 灭菌 段木料袋采用微压灭菌，温度快速上升至105 ℃～110 ℃，连续保温10 h～12 h。 6.2.4 接种 当段木料棒温度冷却至28 ℃以下，在经臭氧或紫外消毒后的洁净室接种。用液体菌种接种器进行一端喷洒接种，每段接种量70 mL～100 mL，接种后扎紧袋口，放入培养室或发菌棚内培养。 6.2.5 发菌培养 把接种后的段木料棒移入发菌室或发菌棚中，堆放层次不超过8层，中间留出50 cm的通风道或采用培养架培养，控制菌木棒在22 ℃～25 ℃温度下培养。培养期间根据气温情况在早、中、晚通风1 h～2 h，空气湿度控制在60%～75%。培养14 d～16 d待菌丝发满整个菌木棒表面后停止加温，自然温度发菌（菌棒最高温不超过30 ℃），每天通风3次～4次，每次20 min～30 min。发现杂菌感染的菌木段要及时搬离。排场前19 d～21 d，培养室或发菌棚给予散射光。 栽培场地选择 选择地势开阔，通风排水良好，水源清洁充足的区域，环境水质、土壤符合NY/T 5010的规定。 场地整理 6.4.1 场地清理 大田栽培在晴天深翻土20 cm，去除杂草、碎石等杂物，日光暴晒1～2d后做畦。 6.4.2 做畦 根据栽培场地的实际情况作成宽0.8 m～1.0 m，高 25cm，沟宽25 cm～30 cm，沟深20 cm～30 cm的畦。菌棒下地前2 d，畦面上撒生石灰，用量为100 g～150 g/m2，浇透水后备用。 6.4.3 搭拱棚 畦床上根据栽培场地大小搭建高1.5 m～2.2 m或0.8 m的拱棚，宽度根据场地调节，棚两端留门，拱棚上覆塑料膜、遮阳网。塑料膜采用聚乙烯塑料，厚度0.004 cm，遮阳网遮阴度为70%～80%。 排场覆土 选择天晴、阴凉的天气把灵芝菌木棒运至场地，平放于栽培畦上，通风见光7 d～12 d，待菌丝表面有少量浅黄色菌皮形成后再脱去外袋，根据畦宽每畦卧倒横排2段～6段，菌木棒间距3 cm～5 cm，行距6 cm～8 cm。菌木棒上面盖2 cm～3 cm的新细土，填实棒间的空隙，覆土后在畦面上淋透水。 出芝管理 6.6.1 通风 在灵芝原基还未形成时，可用通风来调节棚内的温湿度；原基形成到幼芝生长期，应利用棚两端薄膜掀开方式通风；子实体开伞后卷起拱形棚两侧薄膜，加大通风量。 6.6.2 湿度 菌蕾形成至开片时，空气湿度宜保持在90%～95%；子实体开片基本完成，菌盖边缘稍有黄色时，空气湿度宜保持在85%～90%；子实体趋于成熟至孢子弹射期，空气湿度宜保持在80%～85%。 6.6.3 温度 用遮阳、喷水、掀盖膜等方法控制出芝场的温度，最适温度为20℃～30℃。 6.6.4 光照 根据气温和日照情况，在盛夏高温强日照下增加遮阳，使棚内光照强度保持在七分阴三分阳，保持光照均匀。 6.6.5 疏芝 用锋利小刀从基部割去过多芝芽，每根菌木棒保留1朵～2 朵。疏芝原则为去弱留强，去密留疏。 6.6.6 孢子粉收集 灵芝菌盖边缘黄色生长圈消失后即可开始采集，方法符合GB/T 29344相关规定。 6.6.7 采收后管理 采收后及时清理栽培场，对外露的菌段用泥土覆盖保护，厚度2cm 以上，四周挖深排水沟。翌年按6.6的规定再管理1次。 7 病虫害防治 预防为主、综合防治的原则，参照DB33/T 985的规定执行。 8 档案管理 摇瓶液体菌种、一级罐菌种、二级罐菌种生产和接种各环节操作内容，出芝管理中的主要工作参数及时间节点等信息，由技术人员现场详细记录，签字后归档保存。保存期2年。