创面修复材料有效性评价 第 1 部分：水溶性材料体外评价方法

【适用范围】 本文件规定了水溶性创面修复材料体外评价的细胞毒性试验、细胞增殖试验和细胞迁移试验。 本文件适用于适用于水溶性创面修复生物材料促进细胞增殖和迁移效果的评价。 【主要技术内容】 4 细胞毒性试验 4.1 原理 将待测生物材料溶解在培养基中，配成不同梯度浓度的样品，按照GB/T 16886.5—2017确定不同浓度下材料是否具有细胞毒性。 4.2 器具、试剂和耗材、细胞系 4.2.1 器具 试验器具如下： a) 二氧化碳细胞培养箱； b) 恒温水浴摇床； c) 高压蒸汽灭菌锅； d) 倒置荧光显微镜； e) 细胞计数仪； f) 恒温水浴摇床； g) 酶标仪； h) 电子天平； i) 液氮罐； j) 冷冻离心机； k) 96 孔板； l) 细胞培养瓶或细胞培养皿。 4.2.2 试剂和耗材 试验试剂和耗材如下： a) 含 10％新生胎牛血清 DMEM 低糖培养基（含 10％FBS DMEM 低糖培养基）； b) 二甲基亚砜（DMSO）； c) 异丙醇； d) 高密度聚乙烯。 4.2.3 细胞系 L929细胞。 4.3 样品制备 4.3.1 试验样品 准确称取样品溶解在含10％FBS DMEM低糖培养基中，配置成不同梯度浓度的样品，过滤除菌低温保存备用。根据样品现有的细胞毒性数据，配置10个不同梯度浓度的试验样品。 4.3.2 阴性对照 计算直径为1 cm的高密度聚乙烯双面的面积，按3 cm2/mL加入含10％FBS DMEM低糖培养基，37 ℃、120 r/min摇床中浸提24 h，取浸提液使用。 4.3.3 阳性对照 取适量DMSO加入含10％FBS DMEM低糖培养基内，制备10％DMSO溶液，37 ℃、120 r/min摇床中震荡24 h。 4.3.4 空白对照 含10％FBS DMEM低糖培养基，37 ℃、120 r/min摇床中震荡24 h。 4.4 试验方法 按照GB/T 16886.5—2017中附录C规定的MTT细胞毒性试验方法进行，处理条件、检测模型、观察时间按表1进行。试验设置空白对照组、阴性对照组、阳性对照组，试验组，每个试验组设置6个复孔。将复苏好的成纤维细胞传至两代以上呈对数生长期时，按照1×105个/mL密度制备细胞悬液，每孔加入100μL细胞悬液，然后接种到96孔板内，放入二氧化碳细胞培养箱在37℃下培养24 h，移去旧培养基，按照试验设置加入对应培养液，继续培养24 h后，在显微镜下观察每组细胞形态，弃去每组培养液后加入1 mg/mL 50μLMTT溶液，放入细胞培养箱中孵育2 h后弃去孵育液，加入100?L异丙醇，用振荡器上振荡使蓝紫色结晶充分溶解混匀，在酶标仪上检测570nm和650 nm波长的吸光度值并按照式（1）计算细胞存活率。 表1 细胞毒性试验 ??1 =（??570 ???????650 ????）/（??570 ???????650 ????）×100％·····(1) 式中： P1——细胞相对存活率，％； A570 nm——阴性对照组在570nm处的平均吸光度； A650 nm——阴性对照组在650nm处的平均吸光度； B570 nm——阳性对照组在570nm处的平均吸光度； B650 nm——阳性对照组在650nm处的平均吸光度。 4.5 试验用样品浓度的确定 根据细胞毒性试验结果，选择无细胞毒性的高、中、低3个浓度用于细胞增殖和迁移试验。若试验结果的细胞毒性在最高浓度或最低浓度表现为细胞增殖率为最大值，宜进一步增加浓度或降低浓度重新进行细胞毒性试验。 5 细胞增殖试验 5.1 原理 在无血清培养基条件下测定细胞增殖的情况，以无血清培养基为空白对照，含血清培养基为阳性对照。若材料具有促进细胞增殖的作用，则和空白对照相比具有明显细胞增殖反应。 5.2 器具、试剂和耗材、细胞系 5.2.1 器具 同4.2.1。 5.2.2 试剂和耗材 试验试剂和耗材如下： a) 含 10％新生胎牛血清 DMEM 低糖培养基（含 10％FBS DMEM 低糖培养基）； b) 无血清培养基； c) CCK-8 试剂。 5.2.3 细胞系 5.2.3.1 试验可使用的细胞系如下： a) 成纤维细胞； b) 皮肤上皮细胞； c) 食管上皮细胞； d) 胃黏膜上皮细胞； e) 肠黏膜上皮细胞。 5.2.3.2 对于用于不同部位的修复材料选择合适的细胞系，如用于皮肤的修复材料可用皮肤细胞，用 于食管的材料可选择食管上皮细胞。 5.3 样品制备 5.3.1 试验样品 按照细胞毒性试验确认的3个浓度称取样品溶解在无血清培养基中，完全溶解过滤除菌备用。 5.3.2 阳性对照 含10％FBS DMEM低糖培养基，37 ℃、120 r/min摇床中震荡24 h。 5.3.3 空白对照 无血清培养基，37 ℃、120 r/min摇床中震荡24 h。 5.4 试验方法 将在对数生长期内的细胞按照1×105个/mL的细胞密度加入到96孔板内，每孔100 μL，6个复孔。在 细胞培养箱中培养24h后弃去旧培养基，按照表2规定加入对照组和试验组溶液。于24 h、48h和72 h分别观察细胞增殖情况，弃去孔内液体，加入CCK-8溶液，放入培养箱内孵育3h。孵育结束使用酶标仪测量450 nm的吸光度值，按照式（2）计算细胞增殖率，评估试验样品溶液不同浓度对细胞的增殖作用，并筛选出最佳增殖浓度。 表2 细胞增殖试验 ??2 =??450 ????/??450 ????× 100％ ···································································(2) 式中： P2——细胞增殖率，％； A450 nm——阳性对照组不同浓度样品组平均吸光度； B450 nm——空白对照组平均吸光度。 5.5 结果分析 采用统计学方法评价试验结果，并对空白对照组、试验组和/或阳性对照品组各组结果进行综合分 析评估。经统计学分析： a) 在阳性对照和空白对照应有显著性差异（p＜0.05）条件下，试验组和空白对照组比较 p＜0.05，则认为该材料具有促进细胞增殖的效果，否则材料没有促进细胞增殖的作用； b) 若阳性对照和空白对照没有显著性差异（p＞0.05），则试验不成立； c) 若细胞增殖试验表现为增殖抑制作用，该材料可能与培养基中的血清蛋白相互作用，在有血清蛋白存在的情况下可能不会表现出细胞增殖抑制作用，必要时可进一步研究明确其作用机理。 6 细胞迁移试验 6.1 原理 当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个细胞空白区域，即为“划痕”，划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。通过对不同时期划痕区域细胞状态的观察，对细胞的迁移能力进行判断。该方法模拟了细胞在体内愈合过程中的迁移过程。在细胞单层中创建一个“伤口”，在细胞迁移过程中在开始和定期捕获图像以关闭伤口，以及比较图像以确定细胞迁移速率。 6.2 器具、试剂和耗材、细胞系 6.2.1 器具 试验器具如下： a) 二氧化碳细胞培养箱； b) 恒温水浴摇床； c) 高压蒸汽灭菌锅； d) 倒置荧光显微镜； e) 细胞计数仪； f) 恒温水浴摇床； g) 酶标仪； h) 电子天平； i) 液氮罐； j) 24 孔板； k) 细胞培养瓶或细胞培养皿； l) Image J 图像处理软件。 6.2.2 试剂和耗材 试验试剂和耗材如下： a) 含 10％新生胎牛血清 DMEM 低糖培养基（含 10％FBS DMEM 低糖培养基）； b) 无血清培养基。 6.2.3 细胞系 同5.2.3。 6.3 样品制备 同5.3。 6.4 试验方法 按照表3规定将处于对数生长期的细胞按照1×105个/mL的细胞密度铺于24孔板内，每孔加入1 mL，3个复孔，24h后将一灭菌直尺放置于孔板孔上方，用1 mL枪垂直于孔板和直尺间划一道横线，在10×显微镜下观察，拍摄0 h、以及培养12 h、24 h时的细胞图片，应用Image J按式（3）计算不同时间的细胞迁移率，评估生物材料作用后的对细胞迁移的影响。 表3 细胞迁移试验 ??3 =（??0???12//??24）/S0× 100％·································································(3) 式中： P3——细胞迁移率，％； S0——细胞划痕后0 h细胞未覆盖的区域面积； S12——细胞划痕后12h细胞未覆盖的区域面积； S24——细胞划痕后24h细胞未覆盖的区域面积。 6.5 结果分析 采用统计学方法评价试验结果，并对空白对照组、试验组和/或阳性对照品组各组结果进行综合分析评估。经统计学分析： a) 在阳性对照和空白对照应有显著性差异（p＜0.05）条件下，试验组和空白对照组比较 p＜0.05，则认为该材料具有促进细胞迁移的效果，否则材料没有促进细胞迁移的作用； b) 若阳性对照和空白对照没有显著性差异（p＞0.05），则试验不成立。