创面修复材料有效性评价 第4部分：体外微血管形成试验评价方法

【适用范围】 本文件规定了创面修复材料体外评价的样品制备、血管形成试验和结果分析。 本文件适用于适用于创面修复材料促进创面微血管形成效果的评价。 【主要技术内容】 5 血管形成试验 5.1原理 人的血管系统负责将营养物质和氧气运送到几乎所有的器官和组织，并将产生的废物通过循环排除体外。血管生成在组织损伤修复中具有很大的作用，血管的缺损会延缓伤口的愈合甚至造成伤口长期不愈。血管新生有利于黏膜损伤后的修复，因此通过EA.HY926细胞探究水凝胶浸提液对于血管形成的影响。 器具、试剂和耗材、细胞系 5.2.1 器具 试验器具如下： a)二氧化碳细胞培养箱； b)恒温水浴摇床； c)高压蒸汽灭菌锅； d)倒置荧光显微镜； e)细胞计数仪； f)恒温水浴摇床； g)酶标仪； h)电子天平； i)液氮罐； j)冷冻离心机； k)T25细胞培养瓶； l)24孔板； m)基质胶； n)Image J图像处理软件。 5.2.2 试剂和耗材 试验试剂和耗材如下 a)MEM低糖培养基：含10％胎牛血清； b)磷酸缓冲液（PBS）； c)0.25％胰蛋白酶。 5.2.3 细胞系 EA.HY926细胞。 5.3样品制备 5.3.1 试验样品 按照4.1、4.2制备。 5.3.2 空白对照 MEM低糖培养基，37?℃、120?r/min摇床中震荡24?h。 5.4试验步骤 5.4.1 EA.HY926细胞培养 5.4.1.1细胞复苏 将EA.HY926细胞冻存管于37?℃恒温水浴锅内不断晃动，待细胞冻存液完全溶解，将冻存的细胞悬液转移至15?mL离心管内，随后加入MEM低糖培养基，用无菌巴氏吸管吹打均匀后1?000?r/min离心3?min。弃去上清液，用MEM低糖培养基重悬细胞，随后将细胞转移至T25的培养瓶中，在37?℃、5％CO2细胞培养箱中培养，24?h后观察细胞状态，并给细胞换液。 5.4.1.2细胞传代 当细胞密度约为80％时，吸去培养瓶中原有的培养基，使用PBS轻洗两次，加入1?mL～2?mL?0.25％胰蛋白酶消化3?min～5?min，显微镜观察细胞消化情况，当细胞边缘缩小，贴壁松动时，手指轻叩细胞瓶身，肉眼可见细胞脱落，向培养瓶内加入一定量的MEM低糖培养基终止消化，MEM低糖培养基与0.25％胰蛋白酶的比例为5：1。终止消化后，用移液枪轻轻吹打细胞层，吹打时宜尽量减少气泡的产生，将细胞层吹落、吹散，然后将细胞悬液转移至离心管内，1?000?r/min离心3?min，弃去原有培养基，加入3?mL～5 ?mLMEM低糖培养基，将细胞重新混悬，取适量混匀的细胞悬液于细胞培养瓶内，在37?℃、5％CO2细胞培养箱中继续培养。传代比例为1：4，2天～3天传代。 5.4.1.3细胞冻存 细胞消化后，1?000?r/min离心3?min，加入冻存液将细胞混匀，取10?L细胞悬液用细胞计数仪计数，然后将混匀的细胞悬液放入冻存管中，每管1?mL，冻存密度为1×105/mL～1×106/mL。冻存管上应标明冻存细胞的名称、密度、代数以及冻存人和冻存时间。冻存细胞先4?℃放置10?min，再-20?℃放置30?min，然后-80?℃过夜，梯度降温后将细胞转移至液氮中保存。 5.4.2 小管形成试验 小管形成试验步骤如下： a)将基质胶放入冰箱4?℃过夜缓慢融化。枪头、24孔板等放入冰箱-20?℃预冷； b)将基质胶以每孔200?L缓慢加入预冷的24孔板中，避免气泡产生，注意操作过程中手持EP管上方，手心不应接触EP管； c)将铺有基质胶的24孔板放入冰箱4?℃静置15?min，然后转移至37?℃培养箱中静置30?min，使其凝固； d)待细胞融合至80％左右时，将细胞消化、离心并分别用试验液和空白对照液重悬细胞，随后细胞以1×105/mL加入24孔板中，每孔1?mL，3个复孔。放入恒温细胞培养箱中继续培养，分别在3?h、6?h、9?h观察小管形成情况； e)将细胞按照d）步骤铺板，在6?h时将细胞固定免疫荧光染色，显微镜下观察小管形成情况，并拍照，Image J计算成管数量，观察浸提液对血管形成的影响。 6 结果分析 6.1附录A给出了体外微血管形成试验方法的实例。 6.2小管形成试验结果：在观察时间内血管形成情况的描述，并给出显微镜下图片结果。 6.3免疫荧光染色结果：评价血管网形成的数量和血管形成的总长度，采用统计学评价方法，评价材料促进血管形成的效果，并给出免疫荧光染色的结果图片。经统计学分析试验组和空白对照组比较p＜0.05则认为该材料具有促进血管生成的作用，否则材料没有促进血管生成的作用。